12 guias disenadas: 6 para correccion directa del gen HBB y 6 para disrupcion del enhancer BCL11A. Cada guia fue analizada contra el genoma humano completo (GRCh38.p14 (GCF_000001405.40)).
| Guia | Secuencia (5'→3') | PAM | Estrategia | Hits BLAST | Off-targets | Score |
|---|---|---|---|---|---|---|
| HBB-g20 | GCAAC··········CACCA (20nt) | TGG | Correccion Directa Hbb | 5,778 | 2 MEDIO | 90/100 |
| HBB-g21 | CATGG··········TCCTG (20nt) | AGG | Correccion Directa Hbb | 2,784 | 2 MEDIO | 90/100 |
| HBB-g65 | GCACC··········TTTGA (20nt) | GGT | Correccion Directa Hbb | 4,378 | 2 MEDIO | 90/100 |
| HBB-g66 | TCAGG··········ACCAT (20nt) | GGT | Correccion Directa Hbb | 3,563 | 0 BAJO | 100/100 |
| HBB-g67 | AGACT··········AGTCA (20nt) | GGT | Correccion Directa Hbb | 4,444 | 0 BAJO | 100/100 |
| HBB-g68 | TAACG··········CCTCA (20nt) | GGA | Correccion Directa Hbb | 2,428 | 0 BAJO | 100/100 |
| BCL-g01 | CTAAC··········ATCAC (20nt) | AGG | Disrupcion Bcl11A | 6,858 | 1 MEDIO | 95/100 |
| BCL-g02 | TTGCT··········GCTCC (20nt) | AGG | Disrupcion Bcl11A | 5,487 | 1 MEDIO | 95/100 |
| BCL-g03 | TTTTA··········CAGGA (20nt) | AGG | Disrupcion Bcl11A | 6,100 | 1 MEDIO | 95/100 |
| BCL-g04 | TTTAT··········AGGAA (20nt) | GGG | Disrupcion Bcl11A | 6,230 | 1 MEDIO | 95/100 |
| BCL-g05 | CACAG··········GGGTT (20nt) | TGG | Disrupcion Bcl11A | 7,878 | 1 MEDIO | 95/100 |
| BCL-g06 | GAAGG··········TGATT (20nt) | AGG | Disrupcion Bcl11A | 3,668 | 1 MEDIO | 95/100 |
Cada punto representa un sitio donde CRISPR-Cas9 podria cortar fuera del objetivo. La posicion X muestra la ubicacion en el cromosoma, Y los mismatches (0 = match perfecto = mas peligroso).
Cruce de 12 off-targets de referencia con las variantes geneticas reales de cada paciente (datos de 1000 Genomes Project). Cromosomas personalizados: chr2, chr11, chr14.
Los 5 pacientes comparten un SNP en chr11:5,227,013 (A→G, homocigoto). Esta variante esta en linkage disequilibrium con rs334 (la mutacion SCA, solo 11 bp de distancia). Esto agrava el off-target de la guia HBB-g21 (reduce mismatches de 1 a 0), haciendo que HBB-g66 y HBB-g68 sean las opciones mas seguras.
| Longitud total | 595 nt |
| CDS (codificante) | 444 nt (148 codones) |
| GC content | 47.4% |
| Cap 5' | CleanCap-AG |
| Modificacion | N1-metilpseudouridina |
| Vida media estimada | 18-24 horas |
| Uridinas (m1Psi) | 89 |
5 portadores reales de la mutacion rs334 del Proyecto 1000 Genomes, seleccionados de poblaciones diversas con alta prevalencia de Anemia Falciforme.
| Muestra | ID Exonik | Poblacion | Diagnostico | Mejor Guia | Score | Reporte |
|---|---|---|---|---|---|---|
| HG00640 | EXO-REAL-001 | Puertorriquenos | Portador rasgo falciforme (HbAS) | HBB-g68 | 100/100 | Ver reporte |
| HG01140 | EXO-REAL-002 | Colombianos (Medellin) | Portador rasgo falciforme (HbAS) | HBB-g68 | 100/100 | Ver reporte |
| HG01889 | EXO-REAL-003 | Afrocaribenos (Barbados) | Portador rasgo falciforme (HbAS) | HBB-g68 | 100/100 | Ver reporte |
| HG02594 | EXO-REAL-004 | Gambianos (Div. Occidental) | Portador rasgo falciforme (HbAS) | HBB-g68 | 100/100 | Ver reporte |
| HG02923 | EXO-REAL-005 | Esan (Nigeria) | Portador rasgo falciforme (HbAS) | HBB-g68 | 100/100 | Ver reporte |